如果說(shuō)Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應法將生物學(xué)劃分為前PCR時(shí)代和后PCR時(shí)代，那么數字PCR的產(chǎn)生將分子檢測劃分為了定性檢測時(shí)代和定量檢測時(shí)代。但是數字PCR檢測≠定量檢測，數字PCR只是一個(gè)工具，只有這個(gè)工具具備了定量檢測的條件才能實(shí)現真正的定量檢測，否則都是“偽定量”。
一、什么是定量檢測
1.定性和定量檢測
通俗的理解，定性檢測是測定待測物的“質(zhì)”，如物理、化學(xué)、生物等，鑒定其是與非，有和無(wú)；定量檢測是測定待測物的“量”，如質(zhì)量、長(cháng)度、物質(zhì)的量等等。
2.核酸檢測方法中的定量檢測方法
是否為定量檢測不是以檢測結果是否是數值為依據，對于核酸檢測，OD260/280計算核酸濃度和熒光定量PCR都是定性檢測方法；只有數字PCR屬于定量檢測方法。
3.數字PCR的偽定量
數字PCR是一個(gè)定量工具，但是如果數字PCR方法沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分驗證，獲得的定量結果也只是個(gè)偽定量結果，或者結果不準確，或者偏差較大。目前在數字PCR推廣和使用中最大的問(wèn)題就是：數字PCR廠(chǎng)家只強調儀器的硬件參數（分割單元數、多通道和開(kāi)發(fā)的系統）；用戶(hù)將熒光定量PCR方法在不做方法優(yōu)化和驗證的情況下直接應用于數字PCR平臺，最終的結果是數字PCR成為一個(gè)定量不準的定性檢測工具。
4.計量溯源
要實(shí)現定量，通常需將測量的結果與國際單位制SI單位聯(lián)系起來(lái)。國際單位制的七個(gè)基本單位：長(cháng)度（米）、質(zhì)量（千克）、時(shí)間（秒）、電流（安培）、熱力學(xué)溫度（開(kāi)爾文）、物質(zhì)的量（摩爾）和發(fā)光強度（坎德拉）。
“具有計數特征的量（包括特定核酸序列的拷貝）的單位為1。單位為1的單元本質(zhì)上是任何單元系統的一個(gè)元素。單位為1的量可視為可溯源至SI 單位摩爾。因此，可以通過(guò)適當的、經(jīng)過(guò)驗證的測量程序來(lái)得出對SI的計量溯源性。”-ISO 20395：2019
5.不確定度
追求真值和追求真理一樣困難！定量檢測的最大困難是測準，因為真值永遠是求之而不得的，也是人類(lèi)孜孜不倦努力的目標。我們當下能做到的是獲得真值所在的區間，并不斷縮小這個(gè)區間，這個(gè)區間就是不確定度，它包含了測量中所有產(chǎn)生的誤差（不確定分量）。
1.數字PCR的原理
數字PCR是將核酸模板分布在等體積的多個(gè)分割單元中，使得一些分割單元包含模板而其它分割單元不包含模板，然后對目標序列進(jìn)行PCR擴增并檢測特定的PCR產(chǎn)物，通過(guò)陽(yáng)性率和泊松分布計算獲得模板中靶序列拷貝數濃度。數字PCR的核心原理就是有限稀釋、終點(diǎn)PCR和泊松分布！
2.數字PCR的分類(lèi)
按照單元分割的方式數字PCR分為液滴式數字PCR、芯片式數字PCR和微滴芯片式數字PCR：
2.1液滴式數字PCR：通過(guò)油包水生成技術(shù)，生成幾萬(wàn)個(gè)微滴，以伯樂(lè )和新羿生物為代表：
2.2芯片式數字PCR：使用物理分割的方法，將反應液分布到幾萬(wàn)個(gè)微孔中，以賽默飛、凱杰和羅氏為代表：
2.3微滴芯片式數字PCR：分割方式仍然是生成油包水的微滴，但是將微滴形成單層平鋪到芯片上，以STILLA和思納福為代表：
3.泊松分布
很多人對數字PCR定量結果的質(zhì)疑往往來(lái)源于泊松分布導致的概率，由于以往的核酸檢測都是定性的，人們已經(jīng)習慣了陽(yáng)性或者陰性的“確定性”結果，而不習慣于存在概率和不確定度的“不確定性”結果。但是事實(shí)的情況是越能計算出概率和不確定區間的結果越準確，只給出陰陽(yáng)性的結果越不準確。
1.精密度Precision
精密度可分為方法的重復性（repeatability），中間精密度（intermediate precision）和再現性（reproducibility）。在實(shí)驗室內部驗證時(shí)，應確定方法的重復性和中間精度。可以使用單因素方差分析（ANOVA），計算重復性。
2.線(xiàn)性L(fǎng)inearity
通過(guò)對預期核酸量值與觀(guān)察到的核酸量值進(jìn)行回歸分析，以斜率和相關(guān)系數R來(lái)表征該范圍內的線(xiàn)性度。
觀(guān)察值與期望值的期望斜率為1.0，截距為（0,0）。建議斜率在0.95至1.05之間。相關(guān)系數R2應大于0.99。
3.正確度Trueness
測量正確度是該方法產(chǎn)生的無(wú)限個(gè)結果（即現實(shí)中的大量結果）的平均數與接受參考值間的一致程度。優(yōu)先使用有證標準物質(zhì)獲取合適的參考值。
4.穩健性Robustness
在穩健性測試中，應研究相關(guān)方法參數中的小偏差對方法性能和測量結果的影響。可能影響方法結果的相關(guān)參數，如引物和探針的濃度、PCR試劑的成分、PCR儀和退火溫度。
5.特異性specificity
應評估分析對預期目標的特異性以及與典型生物樣品中可能存在的同源序列的潛在交叉反應性。
6.最低檢測限limit of detection，LOD
可被檢出的最低濃度。LOD在不同標準中有不同的計算方式，如：目視評價(jià)法，空白標準偏差法、標準方程法和信噪比法。對于數字PCR的LOD評估我個(gè)人比較傾向于使用空白標準偏差法評估LOD。
空白標準偏差法：既通過(guò)分析大量的樣品空白或加入最低可接受濃度的樣品空白來(lái)確定LOD。獨立測試的次數應不少于10次，計算檢測結果的標準偏差，計算方法見(jiàn)下表：
7.最低定量限limit of quantitation，LOQ
樣品中的分析物可被定量檢測的最低濃度。通常建議空白值加上10倍重復性標準偏差，也可以3倍的LOD或高于方法確認中使用最低加標量的50%作為L(cháng)OQ。
我從2012年就開(kāi)始接觸數字PCR，后來(lái)因為一直從事核酸標準物質(zhì)的研究，需要不斷的開(kāi)發(fā)數字PCR的定量方法，目前已經(jīng)使用過(guò)的數字PCR儀大概有10種。
數字PCR本應定位為一個(gè)高靈敏度和準確度的定量工具，各廠(chǎng)家應聚焦于如何提高儀器的精密度和準確度，篩選最匹配的反應體系，開(kāi)放平臺扶持專(zhuān)業(yè)的方法開(kāi)發(fā)者。但是目前的一種不良傾向是大家都在拼硬件性能（微滴數更多，熒光通道更多），過(guò)度宣傳自己平臺的開(kāi)放性和通用性，回避普通用戶(hù)自己建立定量方法的難度。硬生生把一個(gè)定量工具變成了更靈敏的定性或偽定量工具。數字PCR是時(shí)候回歸真定量了！
2023-8-21 |
